PCR的应用

授课人：钱雯    江苏省江阴高级中学       

【学习目标】

1.通过设计引物和模拟PCR获取HLA-DRB1基因的活动，明确PCR过程（变性-复性-延伸）、PCR反应体系的组成和引物设计原则。

2.通过地中海贫血的现实情境，认识不同类型的PCR（如PCR、实时荧光定量 PCR、重叠延伸PCR等）及其特点、实际用途，能够比较它们之间的差异与联系。

3.通过针对性习题训练与案例分析，熟练掌握高考中常见的PCR考点题型，提升在高考语境下对PCR知识的灵活运用能力。

【重点难点】

教学重点：PCR过程（变性-复性-延伸）、PCR反应体系的组成成分和引物设计原则。

  教学难点：不同类型PCR的特点及实际用途。

【基础知识】

1.细胞内DNA复制与PCR技术的比较

 

2.过程及图解

 

 

 

 

 

 

  

                            

【学习过程】

任务一：引物设计原则和PCR扩增过程

资料1：对于患有重型地中海贫血的患者而言，造血干细胞移植是他们根治疾病、重获健康的唯一希望。加入中华骨髓库大大增加了患者找到合适供者的概率。加入中华骨髓库的第一步是需要采集口腔粘膜样本，利用PCR技术进行低分辨率的白细胞抗原（HLA）分型。

问题1：在进行PCR操作时，科研人员按下表反应体系向试管中加入各试剂，由细胞内DNA复制的过程推测，这些材料的作用分别是什么？

[活动1]设计引物

下图为HLA-DRB1的部分基因序列，尝试设计长度为20bp的引物1和引物2：

引物1：5'—CCTATAACTT GGAATGTGGG—3'   引物2：3'—AATTTTT TTTTTTTTTT TTT—5'                                      

问题2：设计引物的碱基序列主要依据是什么？

目的基因两端的部分核苷酸序列

问题3：PCR为什么需要引物？

TaqDNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有链的3′端，引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端

问题4：上游引物为5'-TGGAAATGGCGCCATTTCCA-3'、下游引物为5'-TTGCCTCCTCGCTGTACTTG-3'其中哪条引物设计不合理？原因是什么？

上游引物；自身易发生碱基互补配对进行折叠，影响引物与DNA模板链的结合

问题5：为了便于扩增的DNA片段与载体连接，需在引物的  5′端加上限制酶切割位点，原因是？

使引物在3′端与模板严格互补配对，保证子链的延伸

 

【典例1】过程①中添加的一对引物是___P1和P3___。

P1:5'-GCGAATCATATGGGCGGCGTTCTGTTTCTG-3'

P2:5'-CCGATTAAGCTTGGCGGCGTTCTGCATCTG-3'

P3:5'-CGCGGATCCATAAGGCAGTAAAGAGGTTTTG-3'

P4:5'-GCCGGATCCACAAGGCAACGCCGCCTGCCTT-3'

 

 

 

 

【典例2】如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是( C )

A．用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序

B．用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序

C．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序

D．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序

【典例3】(多选)采用PCR技术对该DNA分子进行扩增时，下列选项可能导致非特异性扩增比例增大的原因有(ACD)

A．引物序列过短     B．延伸时间过长    C．退火温度过低     D．扩增循环过多

【归纳】引物的设计原则：

（1）引物的长度：一般引物设计为长20～30bp；过长过短都会降低  特异性   ；

（2）引物两端的碱基序列：引物的_3＇_（填5＇或3＇）必须与模板正确配对，可在引物的__5＇_（填

5＇或3＇）添加限制酶切位点。

（3）引物的碱基组成：G和C的含量应在40%～60%之间，引物G和C的含量过低，会导致PCR过程

中____退火______温度较低，不利于提高PCR的特异性，但G和C的含量过高需要设定更高的退火温度，也不利于PCR扩增产物。退火温度的设定除了与引物碱基组成，还与引物长度有关。

 

 

[活动2]模拟PCR获取HLA-DRB1基因过程：

 

用个数加图中字母表示：第一轮循环产物     1个①，1个②                      

                      第二轮循环产物  1个①，1个②，1个③，1个④          

                    第三轮循环产物 1个①，1个②， 2个③，2个④，2个⑤   

问题6：至少需要循环_3__轮开始出现两条单链等长的目的片段。经4轮循环后，图中⑤所示的DNA分子数占DNA分子总数的比例为___1/2____，从理论上推测，第四轮循环产物中不含有引物1的DNA片段所占的比例为____1/16______。

【典例4】已知引物1及引物2之间的序列为目的序列,若引物与DNA的结合位点如下图所示，在第  2  轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。

 

任务二：实时荧光定量PCR

资料2：地中海贫血是一种由于珠蛋白基因突变或缺失，导致珠蛋白肽链合成减少或完全缺失引起的遗传性溶血性贫血。由于目前缺乏有效的治疗手段，利用实时荧光定量PCR进行产前基因诊断，阻止重症胎儿出生是国内外公认的首选措施。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，即每扩增 1次，就有1个荧光分子生成。

问题7：根据Taqman探针功能分析，探针中碱基序列设计的主要依据是什么？

珠蛋白基因的一段序列  

问题8：根据图1和图2，Taq DNA聚合酶有什么作用？

催化DNA子链的延伸，催化RNA(Taqman探针)的水解

问题9：若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与什么有关？

扩增次数和样品中珠蛋白基因的初始数量

 

 

 

任务三：重叠延伸PCR

资料3：通过重叠延伸PCR引入特定的突变到正常基因序列中，然后将突变后的基因导入细胞或胚胎干细胞，培育出地中海贫血的细胞系或动物模型，用于深入研究疾病的发病机制、病理过程以及筛选潜在的治疗药物靶点。某科研团队希望运用重叠延伸PCR技术在珠蛋白基因中的特定位点引入特定突变，使珠蛋白第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG）。

问题10：若拟突变位点的碱基对为A-T，需要让其突变为什么才能达到目的？引物2的突变位点（凸起处）应设计为怎样的位点？

T-A或C-G；A或G

问题11：在第1阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应体系和引物3、引物4组成的反应体系中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生多少种DNA分子？必须将引物1、2 和引物3、4 置于不同反应系统中的原因是什么？

3种；引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应体系时它们会发生结合而失去作用

问题12：利用重叠延伸PCR技术还可以将2个不同来源的 DNA 片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是什么？

M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段

【课堂检测】

1.数字PCR即Digital PCR（dPCR），它是一种核酸分子绝对定量技术。数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。下图为数字PCR技术的原理图，有关叙述错误的是( D )

 

A．dPCR反应体系需要加入一定的缓冲溶液和Mg²⁺

B．dPCR是基于DNA单分子PCR方法进行计数的核酸定量

C．每个反应单位有无荧光取决于是否含有靶分子

D．PCR和dPCR在检测病原体的灵敏度上相同

2.通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述错误的是( D )

 

A．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入

B．在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、Taq酶等

C．第3轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因

D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2